La chromatographie d’exclusion stérique, appelée également Chromatographie par perméation de gel ou Size exclusion chromatography (SEC) en anglais, est une méthode de chromatographie liquide qui permet de séparer des macromolécules en fonction de leurs volumes hydrodynamiques et leurs structures.
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Quel est le principe de la chromatographie d’exclusion stérique ?

Le principe de la chromatographie d’exclusion stérique est basé sur le tamisage moléculaire. La technique consiste à séparer en solution les molécules, de la plus grande à la plus petite. Celles ayant une grande taille, avec un diamètre supérieur à celui des pores, sont exclues du garnissage, et donc éluées en premier dans le volume mort. Les plus petites pénètrent dans les pores à des degrés variés selon leur calibre. Elles sont éluées plus tardivement.

La SEC convient parfaitement pour séparer et quantifier des mélanges de protéines. Il s’agit d’une technique précieuse pour le contrôle qualité dans la fabrication de protéines recombinantes. C’est une solution efficace pour l’analyse de protéines intactes de contaminants qui peuvent renfermer des agrégats, des débris cellulaires et d’autres impuretés résultant de la dégradation. Pour cela, des granules de gel poreux, du gel hydrophile ou du gel hydrophobe, sont utilisés.

Quel matériel utiliser pour une chromatographie d’exclusion stérique ?

L’appareil de chromatographie d'exclusion stérique est similaire à celui de l'HPLC classique (Chromatographie Liquide Haute Pression). Il est composé d’un réservoir de solvant, d’un système de pompage, d’un injecteur, d’un jeu de colonnes et de détecteurs disposés en sortie de colonne. Tous les composants de l’appareil sont reliés par des connexions à faible volume mort et des tubes capillaires, en acier inoxydable ou en plastique, pour minimiser l’élargissement des pics dû à l’appareillage. Les détecteurs les plus efficaces sont ceux à barrette de diode et ceux à réfractomètre.

Quel intérêt apporte la SEC ?

La chromatographie d'exclusion stérique permet d’avoir des informations intéressantes de caractérisation :

  • Les masses molaires moyennes : Mn, Mp, Mw, Mz.
  • La distribution des masses moyennes aussi appelée dispersité Ð.
  • La taille des macromolécules en solution : Rg, Rh.
  • La structure du polymère (linéaire, ramifié…)
C’est une technique adaptée pour un chercheur ou un industriel qui souhaite :

  • Caractériser un polymère de synthèse, une protéine.
  • Contrôler la cinétique d’une réaction de polymérisation.
  • Analyser un produit manufacturé.
  • Connaître l’évolution des caractéristiques macromoléculaires (Mn, Mw, Ð) d’un polymère dans le temps.